补偿机制讲解（一）

1. 如何理解流式细胞术中的”补偿“？

补偿是流式细胞术中最关键，然而同时又极难理解的一个概念。就像设置合理的电压、了解所用荧光染料的发射和激发波长一样，补偿也是一个成功的流式细胞术所必须的。了解补偿的概念，需要搞清荧光的物理学基础。由于不同荧光的物理学特性不同，及我们所用的流式细胞仪，决定了必须进行“补偿”。

补偿：在流式细胞术中，补偿是指用数学方法纠正光学检测器件由于荧光重叠造成的检测误差。我们需要探测某种荧光素的荧光信号时，需要通过一系列滤光片。

图1

这一切都始于荧光；也就是说，一个吸收了较低波长光子的分子发射出一个光子。在激发的过程中，荧光分子被激发；也就是说，一个电子被移动到一个更高的能量状态。为了释放这种能量，分子会发射出一个波长更高的光子。如图1所示的荧光素，这种发射发生在大约519纳米的最大值，但延伸到远处的橙色光谱（超过600纳米）。

图2

当我们想测量这个荧光素信号时，问题就来了。正如我们之前讨论的那样，流式细胞仪使用光电倍增管（PMT）来将光子转化为电子。如果有任何光子击中PMT就会产生光电流；因此我们使用过滤器来限制进入每个PMT的光线。在下面的图2中，荧光素信号在BandPass 530/30过滤器中被测量。然而，你可以看到，在585/42滤光片中也有一定比例的信号（大约12%）。这就是荧光素溢出到藻红蛋白（PE）通道的情况。

图3

这种溢出在我们的数据图中表现出来，如图3所示。根据这个图，它显示了用荧光素标记的抗体标记的人类PBMCs（外周血单核细胞），在PE检测器中观察到一个信号。我们想要的信号显示在绿色箭头中。 溢出的信号可以看到红色箭头。

Compensation is the process of correcting the spillover from our primary signal in each secondary channel it is measured in. （补偿是纠正我们的主要信号在每个次要通道中的溢出的过程，它被测量）

在最简单的层面上，我们正在计算未染色群体和完全染色群体的中位数之间的线的斜率。如图4所示，这个斜率就是我们用来校正信号的。

如果你使用的是仪器，并且仍然在进行手动补偿，请确保你使用统计数据来产生这个值。

更准确和黄金的补偿标准是自动补偿。它源于Bagwell和Adams（1993）的一篇论文（Ann NY Acad Sci 20:167-184）。如该论文所述，如图5所示（图2来自Bagwell和Adams的论文），有几种方法，但最准确的方法是使用自动补偿（Herzenberg等人（2006 Nature Immunol 7:68-68）等）。调查者没有理由用不同的工具传播进行手工补偿的工作。如果你运行的流式细胞仪没有自动补偿包，最好是在没有补偿的情况下收集数据，并使用第三方软件包来进行补偿。只要你遵循补偿的三个基本规则（见下文），自动补偿是准确的。

那么，我们为什么要进行补偿？

首先是我们对一维和二维可视化和门控工具的依赖。事实上，目前正在开发的许多聚类软件包在运行前都需要补偿数据。其次，我们需要确保没有被显示的荧光体的贡献不会影响数据的分布。

补偿需要遵循三个规则。这些规则是：

对照品的亮度至少要和应用补偿的任何样品一样。

对于任何给定参数的阳性和阴性对照组，背景荧光应该是相同的。

你的补偿颜色必须与你的实验颜色相匹配。

还有一个额外的规则--收集足够的事件。

由于荧光的物理特性，流式细胞仪实验中需要补偿。荧光色素被激发，并在一定的波长范围内发射出一个光子。其中一些光子会溢出到第二个检测器中，导致单一染色的样本出现双阳性。我们对我们的数据进行数学校正，以解决这种溢出问题--这就是补偿。